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(资料图)
今天推荐的是由上海交通大学医学院在2019年6月19日发表于Autophagy（IF：，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Chuanxin Huang教授，研究表明泛素特异性蛋白酶USP8直接对SQSTM1/p62进行去泛素化，以抑制其自噬活性。
研究背景
SQSTM1/p62（sequestosome 1）是一个关键自噬受体，促进泛素化聚集物的形成和降解。SQSTM1可以被泛素化修饰，这种修饰可以调节其自噬活性。然而，支持其去泛素化的分子机制从未被报导过。
摘要部分
作者报道了USP8（泛素特异性肽酶8）直接与SQSTM1相互作用并使其去泛素化。USP8优先去除SQSTM1的赖氨酸11（K11）连接的泛素链。此外，USP8主要在SQSTM1的泛素关联（UBA）域的K420处进行去泛素化。最后，USP8抑制了有野生型SQSTM1的细胞中SQSTM1的降解和自噬，用精氨酸取代K420的突变体则没有该功能。综上所述，USP8通过在K420处对SQSTM1进行去泛素化，成为自噬的一个负调节器。
研究内容
与自噬受体SQSTM1相互作用
USP8/UBPY定位在内体区间，调节包括表皮生长因子（EGF）受体在内的许多蛋白质的内体排序。作者首先研究了USP8是否能与SQSTM1相互作用。为此，作者将USP8-HA或空载转染到HEK293T细胞，该细胞表达内源性SQSTM1和USP8。作者发现，内源性SQSTM1只在USP8-HA转染的细胞中与抗HA抗体共免疫沉淀。此外，内源性USP8与抗SQSTM1抗体共同免疫沉淀。从大肠杆菌中纯化的His-USP8被纯化的GST-SQSTM1蛋白特异性结合，表明USP8在体外与SQSTM1直接相互作用。
另一方面，作者发现，使用抗Flag抗体，USP8-HA不能被Flag标记的SQSTM1截断突变体（失去残基85-233）免疫沉淀。这个片段包含锌指（ZZ）和TRAF6结合（TB）结构域。最后，免疫荧光显示，内源性USP8与SQSTM1在HeLa细胞的核周区域共同定位。
研究结论：USP8直接与SQSTM1相互作用。
在体外和体内使SQSTM1去泛素化
考虑到USP8是一种去泛素化酶，作者接下来研究USP8是否在体外直接对SQSTM1进行去泛素化，作者分别用纯化Flag标记的泛素化的SQSTM1和HA标记的USP8或其催化不活跃的突变体（USP8C786A），将两者孵化指定的时间，然后用抗His抗体进行免疫印迹。USP8明显降低了SQSTM1泛素化的水平。这种效果需要USP8的DUB活性，因为USP8C786A不能减少SQSTM1的泛素化。表明USP8在体外直接对SQSTM1进行去泛素化。作为阴性对照，BAP1（BRCA1相关蛋白1）去泛素化酶未能减少体外产生的SQSTM1泛素化物种的水平，表明USP8在控制SQSTM1泛素化方面的特异性。
作者接下来试图确定USP8是否会影响体内SQSTM1的泛素化。为此，作者将His-SQSTM1和USP8-Flag转染到HEK293T细胞。作者发现，野生型USP8，而不是USP8C786A突变体，减少了SQSTM1的泛素种类。作者还观察到，USP8能够减少应激条件下诱发的SQSTM1的泛素化。泛素化的SQSTM1与泛素化的蛋白一起，不断地被招募到成长中的自噬体中进行溶酶体的降解。在基础条件下，泛素化的SQSTM1在细胞中几乎检测不到。据报道，用巴菲霉素A1（BafA1）处理，这是一种通过阻断自噬体/溶酶体融合的自噬抑制剂，会导致泛素化的SQSTM1蛋白在细胞中的积累。作者发现，在BafA1处理的MEFs中，敲减内源性Usp8明显增强了内源性SQSTM1的泛素种类。
研究结论：USP8是SQSTM1的去泛素酶。
优先去除SQSTM1的k11连接泛素链
据报道，SQSTM1已被K29-、K33-、K48-和K63连接的聚泛素链修饰。USP8已被证明可以去除K48-、K63-、K11-和K6-连接的泛素链。为此，作者将His- SQSTM1、USP8-Flag和各种HA标记的Ub突变体转染到HEK293T细胞。USP8的过量表达明显抑制了SQSTM1的野生型和K11连接的泛素化，并在较小的程度上抑制了K48和K63连接的泛素化。使用针对K63和K48连接的泛素链的特异性抗体，作者发现USP8敲减并没有增加细胞中内源性SQSTM1的K63和K48连接的聚泛素化，表明内源性USP8对于去除SQSTM1的K48和K63连接的泛素链是不需要的。
研究结论：USP8优先从SQSTM1上清除K11连接的泛素链。
主要在K420处使SQSTM1去泛素化
作者接下来确定SQSTM1的哪些赖氨酸残基可能会受到USP8的影响。最近报道，UBA结构域中的残基K420是SQSTM1的主要泛素化部位。K420的泛素化增强了SQSTM1的螯合活性和选择性自噬。因此，作者重点研究了USP8对K420泛素化的影响。作者将420位的赖氨酸残基突变为精氨酸，生成SQSTM1K420R突变体。作者将His-野生型SQSTM1或SQSTM1K420R突变体与USP8-Flag和HA-Ub一起转染到HEK293T细胞。与以前的报告一致，作者发现与野生型SQSTM1K420R突变体相比，附着在SQSTM1K420R突变体上的HA-Ub数量急剧减少。与野生型SQSTM1相比，USP8的过量表达对SQSTM1K420R突变体的泛素化没有明显影响。此外，SQSTM1K420R突变体显示出与K11相连的泛素化减少。然而，野生型SQSTM1和SQSTM1K420R突变体拥有类似数量的K48和K63连接的泛素链，这表明K420没有经过K48或K63连接的泛素化修饰。正如预期的那样，USP8的过量表达并不明显影响SQSTM1K420R突变体的K48或K63连接的泛素化。最近，KEAP1（kelch-like ECH-associated protein 1）被证明在K420处泛素化SQSTM1，以增强SQSTM1的扣押活性和自噬降解。因此，作者试图确定USP8是否与KEAP1竞争SQSTM1在K420的泛素化。USP8的过表达削弱了由KEAP1过表达诱导的野生型SQSTM1的泛素化。在SQSTM1K420R突变体中没有观察到这种效果。因此，USP8拮抗KEAP1对SQSTM1在K420的泛素化作用。总之，这些结果表明，USP8主要是在K420处消除了SQSTM1的泛素化。
研究结论：USP8主要是在K420处消除了SQSTM1的泛素化。
敲减促进SQSTM1的自噬降解
据报道，SQSTM1在K420处的泛素化可增强SQSTM1的自噬降解。USP8在K420残基处对SQSTM1进行去泛素化，因此作者推断USP8可能调节SQSTM1的自噬降解。作者首先检查了USP8过表达对SQSTM1蛋白丰度的影响。过量表达USP8，而不是USP8C786A突变体，增加了HEK293T细胞中内源性SQSTM1蛋白的水平。此外，在MEFs中敲减内源性Usp8会显著减少SQSTM1蛋白的表达。
作者还测量了USP8对内源性SQSTM1蛋白的半衰期的影响。作者用蛋白合成抑制剂环己酮（CHX）处理混杂的或Usp8敲减的MEFs。敲减Usp8明显缩短了SQSTM1蛋白在MEF细胞中的半衰期，表明USP8在维持SQSTM1蛋白的稳定性方面发挥了关键作用。SQSTM1的降解主要是通过自噬介导的；因此，自噬途径的中断导致SQSTM1蛋白在细胞中的积累。正如预期的那样，用BafA1处理后，MEFs中的SQSTM1蛋白水平增加。最后，作者发现Usp8敲减并没有导致atg7./- MEFs中SQSTM1蛋白水平的降低，而这些细胞缺乏自噬功能。
研究结论：USP8保护SQSTM1免受自噬降解的影响。
作为基础自噬的负调节器发挥作用
SQSTM1在其UBA结构域内的K420处的泛素化增强了SQSTM1介导的泛素化底物被招募到自噬体中进行降解。USP8在K420处对SQSTM1进行去泛素化，并抑制其自噬降解，表明USP8可能在自噬体的形成和自噬通量中发挥重要作用。BafA1阻止自噬体-溶酶体的融合，随后导致LC3-II的积累，LC3-II与自噬体膜紧密结合，是自噬的标志。正如预期的那样，BafA1处理导致了LC3-II的积累。过度表达USP8，但不表达USP8C786A突变体，会降低LC3-II的水平。作者接下来研究了USP8敲除对自噬的影响。与野生型对照组相比，在基础条件下，HeLa细胞中的USP8敲除的LC3-II水平高得多。此外，与野生型对照组相比，BafA1处理导致USP8敲减的HeLa细胞中积累更多的LC3-II。
蛋白酶体抑制剂硼替佐米，可以诱发细胞中的SQSTM1聚集。K420的泛素化是形成SQSTM1聚集物的关键。在硼替佐米处理后，USP8敲减的HeLa细胞比野生型细胞形成更大的SQSTM1聚集物。
研究结论：USP8是基础自噬的一个负调节器。
通过直接对SQSTM1的K420进行去泛素化来调节SQSTM1的降解和自噬作用
自噬的激活可以诱导SQSTM1的降解，USP8可能调节其他底物来影响SQSTM1的降解和自噬。接下来，作者试图研究USP8是否通过在K420处对SQSTM1进行去泛素化来影响SQSTM1蛋白水平和自噬。敲减Usp8对sqstm1./- MEFs中LC3-II的水平没有明显影响，表明SQSTM1在USP8介导的自噬中起着关键作用。此外，使用shRNA从HEK293T细胞中去除内源性SQSTM1，随后将SQSTM1K420R突变体引入这些细胞，生成SQSTM1K420R突变表达的HEK293T细胞。作者发现，USP8的过表达并没有明显改变这些细胞中SQSTM1K420R突变体和LC3-II的水平。
研究结论：USP8通过在K420处对SQSTM1进行去泛素化调节SQSTM1的活性和自噬。
结论与讨论
去泛素化酶(DUBs）是进行蛋白泛素化的逆转过程的蛋白酶。据报道，一些DUBs通过去泛素化自噬途径的成分来调节自噬，例如，USP14通过负向控制BECN1的K63连接的多泛素化来调节自噬。USP19通过去泛素化BECN1来调节自噬和抗病毒免疫反应。目前，SQSTM1的特异性去泛素化酶还没有被确定。这里作者发现, USP8直接与SQSTM1相互作用并对其进行去泛素化，并在K420处去除SQSTM1的泛素化。USP8敲低导致SQSTM1的自噬降解和自噬通量增加。作者的研究确定了USP8是sQSTM1的一个关键和真正的去泛素化酶，同时，研究结果也验证了自噬受体的泛素化是控制选择性自噬的一个重要调节机制的观点。
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原文链接：.1635381
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